Фотометрия

Бихроматическое измерение

В лабораторной диагностике зачастую возникают ситуации, когда нужно провести измерение оптической плотности на двух длинах волн. Такие измерения называются бихроматическими.

Теоретическое обоснование проведения такого измерения следующее: в биологических жидкостях присутствует огромное количество различных веществ, некоторые из которых могут обладать собственной оптической плотностью или вступать в неспецифические реакции с компонентами диагностический наборов, при этом зачастую биологические жидкости могут проявлять свойства коллоидных растворов и не только поглощать, но и рассеивать свет. Поэтому для того, чтобы учесть влияние этих интерферирующих факторов оптическая плотность рассчитывается как разность между оптической плотностью на основной длине волны (о ней уже шла речь выше) и другой длине волны, которая обычно называется опорной или отсекающей, оптическая плотность на которой, как считается, обусловлена неспецифическими факторами.

Приведенная в предыдущем разделе конструктивная схема фотометра называется монохроматической. Исторически она возникла первой, но в современных машинах практически не используется.

Монохроматической она называется потому, что в каждый конкретный момент времени считывание оптической плотности проводится только на одной длине волны и для того, чтобы провести бихроматическое измерение нужно, например, физически поменять светофильтр или изменить угол поворота призмы или дифракционной решетки. В некоторых вариантах проведения фотометрии это неприемлемо (например, кинетические измерения). Поэтому в дальнейшем была разработана полихроматическая схема детекции, которая позволяет считывать оптическую плотность раствора на нескольких длинах волн. Этого было достигнуто разложением полихроматического света в спектр уже после прохождения через поглощающий раствор (то есть перенесением монохроматора за кювету с образцом) и установкой сразу нескольких фотодетекторов для разных длин волн.

Полихроматическая схема детекции

Такая схема позволяет проводить измерение на нескольких длинах волн одновременно.

Что может определит акушер-гинеколог по результатам фетометрии?

Проводя фетометрию и расшифровывая ее результаты, врач-гинеколог опирается на данные таблицы, в которой приводятся все основные параметры внутриутробного развития ребенка. Вот данные средних показателей роста, веса, бипариетального размера головы (расстояние между теменными косточками), длины бедровой кости, диаметра грудной клетки в развитии плода по неделям.

Помимо параметров, приведенных в таблице, акушер-гинеколог обращает внимание на размеры:

плодного яйца, в котором развивается ребёнок (краткое обозначение — ПЯ);
длину от темени до копчика (КТР);
окружности головы (ОГ) и живота (ОЖ);
голени (ДГ) и плеча (ДП), а в последнем триместре и носовой кости (ДНК)– измеряется их длина;
лобно-затылочный (ЛЗР);
живота – сагиттальный, в передне-заднем направлении, (СДЖ) и поперечный (ПДЖ) диаметр;
толщину воротникового пространства (ТВП).

Все они являются примерными, а это вполне допускает небольшие расхождения в результатах, но в пределах, как правило, не более 2 недель.

Сколько стоит фетометрия

Цена фетометрии зависит от клиники, где проводится обследование, уровня аппарата и сложности диагностики. В нашей клинике фетометрию и другие виды УЗИ для беременных можно сделать по следующим ценам:

69	Ультразвуковое исследование на ранних сроках беременности	1000
70	Исследование плода с 11 нед. по 15 нед.	2000
71	Исследование плода при многоплодной беременностис 11 нед. по 15 нед.	2900
72	Исследование плода 15 нед. по 40 нед.	3100
73	Исследование плода при многоплодной беременностис 15 нед. по 40 нед.	4000
74	Исследование плода с 15 нед. по 40 нед. + доплерометрия	3600
75	Исследование плода при многоплодной беременностис 15 нед. по 40 нед. + доплерометрия	4600
76	Скрининговое ультразвуковое исследование в III триместре при многоплодной беременности (30,0 – 34,0 нед.)	от 4000
77	Фетометрия (ультразвуковая динамика роста плода)	1600
78	Фетометрия при многоплодной беременности (ультразвуковая динамика роста плода) !	2500
79	Допплерометрия при беременности (исследование кровотока в средней мозговой артерии, артериях пуповины плода, маточных артериях)	1000
80	Допплерометрия при многоплодной беременности (исследование кровотока в средней мозговой артерии, артериях пуповины плодов, маточных артериях)	2000

Диагностика проводится на новом современном аппарате. Прочитайте о нем в нашей статье.

Кто расшифровывает результаты фетометрии

Расшифровкой результатов УЗИ беременных занимается гинеколог. Лучше обращаться к специалисту высшей категории, особенно, если фетометрия показала какие-то проблемы.

Расшифровка фетометрии: усредненные показатели

Вот примерные показатели основных параметров фетометрии (все они измеряются в миллиметрах) по триместрам:

Триместр	БПР (бипариетальный размер головки)	КТР (копчико-теменной размер)	ДБ (длина бедра)	ОЖ (окружность живота)	ОГ (окружность головы)
1 (11-12 нед.)	21	48	9	49	24
2 (15-16 нед.)	53	69	40	58	53
3 (32 нед.)	82	98	63	89	83

Кроме 3-х обязательных, или рекомендуемых, фетометрий, врач может назначить дополнительное УЗИ, если в состоянии и развитии малыша обнаружатся какие-то пороки. Это даст возможность вовремя принять меры к их устранению или корректировке. Например, зачастую бывает достаточно изменить рацион питания или степень физических нагрузок будущей мамы, скорректировать плацетарную недостаточность, устранить очаг инфекции и т.п., чтобы все пришло в норму.

Результаты фетометрии – приговор или подсказка к действиям?

Нужно отметить, что внутриутробное развитие ребенка отличается индивидуальностью и некоторой волнообразностью. Поэтому достоверную расшифровку результатов УЗИ способен сделать только акушер-гинеколог, ведущий беременность. Конечно, данные, полученные при каждом обследовании, соотносятся с параметрами в приводимой выше таблице. Однако, они не зря называются средними. В развитии малыша большую роль играет и такой фактор, как генетическая предрасположенность.

Например, если родители отличаются небольшим ростом, некоторое несоответствие всех фактических параметров малыша, т.е. их уменьшение, тем, что считаются нормальными, вполне ожидаемо. Но вот если разница окажется лишь в 1-2 параметрах и причем существенная или параметры отличаются от нормы — отстают/опережают – более, чем на 2 недели или на 2 строчки в таблице, это уже станет поводом к выяснению причин подобного явления и назначению дополнительных диагностик.

Именно благодаря фетометрии, гинеколог совместно с генетиком могут еще на ранней стадии развития малыша диагностировать такие серьезные заболевания, как гидроцефалия (нарушение развития головного мозга), гипотрофия (несоответствие массы плода его длине, вызванное дефицитом питания), задержка внутриутробного развития и др.

В подобных случаях разработка индивидуальной программы ведения беременности, обязательно включающей проведение экстренных терапевтических мер и внесение корректив в режим жизни беременной женщины, практически всегда дают положительные результаты, и на свет появляется здоровый малыш.

Так что, фетометрия – это прекрасный способ познакомиться со своим малышом еще до его рождения и убедиться в том, что его развитие, так же, как ход всей беременности, протекает без осложнений.

Написание и издание Фотометрия

Ламберт начал проводить фотометрические эксперименты в 1755 году и к августу 1757 года имел достаточно материала, чтобы начать писать. Из ссылок в Фотометрия и каталог его библиотеки, проданный с аукциона после его смерти, ясно, что Ламберт консультировался с оптическими работами Ньютона, Бугера, Эйлера, Гюйгенса, Смита и Кестнера. Он закончил Фотометрия в Аугсбурге в феврале 1760 года, и к июню 1760 года типография получила книгу.

Мария Якобина Клетт (1709–1795) была владелицей Эберхарда Клетта Верлага, одного из самых важных аугсбургских «протестантских возвещателей». Она опубликовала множество технических книг, в том числе книгу Ламберта. Фотометрия, и еще 10 его работ. Клетт использовал для печати Кристофа Питера Детлеффсена (1731–1774). Фотометрия. Его первый и единственный тираж был явно небольшим, и в течение 10 лет было трудно получить экземпляры. В обзоре оптики Джозефа Пристли 1772 года «Фотометрия Ламберта» фигурирует в списке еще не приобретенных книг. Пристли конкретно упоминает Фотометрия; что это важная книга, но ее невозможно достать.

Сокращенный немецкий перевод Фотометрия появился в 1892 г., французский перевод в 1997 году, и английский перевод в 2000 году.

Проведение калибровки

Как уже было сказано выше оптическая плотность и концентрация определяемого вещества связаны линейной зависимостью.

Отсюда следует, что, зная уравнение прямой для данной зависимости мы можем по любой известной оптической плотности узнать концентрацию интересующего нас вещества.

Для того, чтобы узнать это уравнения проводится процедура калибровки.

На практике если калибровка делается вручную процедура заключается в построении так называемой калибровочной кривой (которая в случае фотометрического измерения чаще всего является прямой линией :).

Для построения линейной зависимости требуется как минимум две точки.

Для начала берется раствор с известной концентрацией вещества (калибратор), которое мы собираемся измерять. После проведения соответствующей химической реакции измеряется оптическая плотность получившейся реакционной смеси, при этом на графике по оси абсцисс откладывается концентрация вещества в растворе, а по оси ординат получившаяся оптическая плотность. Таким образом мы получаем первую точку на графике. Для получения второй точки можно использовать раствор с другой концентрацией, но на практике исходят из предположения, что раствор с нулевой концентрацией обладает нулевой оптической плотностью и в качестве второй точки просто берется начало координат (на самом деле это не так, но это преодолевается при помощи специальных процедур настройки прибора), что позволяет проводить калибровку большинства показателей биохимии по калибратору только с одним уровнем концентрации.

Таким образом получается график, используя который, можно по известной оптической плотности определить концентрацию вещества в растворе.

Калибровочный график

В современный лабораториях калибровку как правило вручную не проводят, это делается автоматически биохимическими анализаторами или другими приборами с фотометрической детекцией на борту.

Суть остается той же за исключением того, что прибор делает расчет для нахождения функции, описывающей калибровочный график, и далее использует ее для расчета концентраций. Калибровочный график при этом строится исключительно для удобства пользователя.

В общем виде функция, описывающая прямую линию, выглядит следующим образом:

y=ax+b

Где:

y — оптическая плотность
x — концентрация исследуемого вещества
a — тангенс угла наклона нашей прямой (фактор калибровки)
b — оптическая плотность при нулевой концентрации, как правило равна нулю

Поскольку значение b при помощи настроек прибора приводится к значению ноль, то вся процедура калибровки сводится к нахождению фактора калибровки, при умножении на него оптической плотности анализатор в дальнейшем вычисляет все концентрации интересующего нас вещества.

Как проводится фетометрия?

Итак, фетометрия – это детальное обследование состояния мамы и малыша с использованием аппарата УЗИ. Беременным женщинам оно проводится двумя способами:

трансвагинально – с введением наконечника датчика во влагалище;
трансабдоминально – содержимое матки рассматривается через внешнюю брюшную стенку.

Трансвагинальное УЗИ рекомендовано женщинам на ранних сроках беременности. Оно позволяет врачу довольно хорошо рассмотреть состояние внутренних органов женщины и формирующегося плода. Особых приготовлений к такому УЗИ не нужно, да и дискомфорта оно не доставляет. А асептический эффект достигается благодаря использованию презерватива, который надевается на датчик.

Трансабдоминальное УЗИ показано на большом сроке беременности. Живот роженицы смазывают специальным гелем, обеспечивающим хороший контакт наконечнику и коже. А околоплодные воды дают возможность в деталях рассмотреть малыша и определить его пол, вес, размер, а в 3-м триместре даже черты лица. Если же по какой-то причине трансабдоминальная диагностика проводится на раннем этапе беременности, женщине нужно будет прийти на нее с наполненным мочевым пузырем – не ходить в туалет в течение 3-4 часов или за полчаса-час до процедуры выпить около литра обычной воды.

Достоинство УЗИ в том, что женщина сама может видеть картинку, появляющуюся на экране, или получить ее в виде снимка. А все опасения по поводу того, что звуковые волны могут нанести вред ребенку, абсолютно беспочвенны. Еще никто не обнаружил от процедуры УЗИ ничего, кроме пользы.

Возможности и область применения спектрофотометров

Медицина и фармацевтика

Высокая чувствительность приборов к наличию посторонних веществ, а также способность устанавливать, что в исследуемой пробе происходят химические реакции обусловили применение спектрофотометров в медицинских и фармацевтических целях. Для многих лекарственных препаратов известны их спектры поглощения, поэтому процесс проверки чистоты образцов сводится лишь к сравнению получаемых в процессе исследования спектрограмм, что позволяет ускорить процесс контроля качества и сделать его более точным. Также, чувствительность прибора позволяет производить оценку многих проб на предмет происходящих изменений в них, что находит своё применение в ряде медицинских анализов.

Анализ пищи и питьевой воды

Также, как и с медициной, высокая чувствительность приборов позволяет устанавливать наличие малых количеств примесей в исследуемых образцах, что положительно влияет на качество и скорость анализа. Особенно ценным представляется способность спектрофотометров к обнаружению примесей тяжёлых металлов в анализируемых образцах.

Изучение неизвестных веществ

Изучение неизвестных веществ при помощи спектрофотометрии позволяет с высокой точностью определять состав исследуемой пробы. ИК-спектроскопия является важным и часто используемым аналитическим методом в процессе синтеза новых веществ и критически важна для качественного и количественного описания продуктов синтеза.

Металлургия и химпроизводство

Способность спектрофотометров работать с твёрдыми и жидкими пробами приводит к незаменимости этих приборов на металлургических и химических производствах. Спектрофотометрия – один из ведущих неразрушающих методов установления состава сплавов и их контроля. Он также широко применяется на нефтегазохимических производствах при оценке чистоты сточных вод.

Полиграфия, печать цветной графики

Поскольку спектрофотометры используют монохроматический свет, они находят применение в полиграфии и при работе с цветной графикой. Приборы способны с высокой точностью определять цвета и используются для проведения точечных и автоматических анализов, результаты которых нужны для создания максимально точных профилей работы печатного оборудования в соответствии со стандартами ICC – международного консорциума по цвету. ICC был создан в 1993 году такими лидерами индустрии, как: Apple, Agfa, Adobe, Kodak, Microsoft, Silicon Graphics, Sun Microsystems и Taligent.

Определение состава сточных и природных вод

Высочайшая чувствительность метода позволяет определять даже мизерные, следовые количества многих веществ. В работе, связанной с анализом сточных и природных вод, это свойство спектрофотометров делает приборы незаменимыми при обнаружении наиболее опасных примесей. Примером очень опасных примесей могут служить металлоорганические соединения ртути. Именно этот класс веществ ответственен за возникновение у человека такой болезни как синдром Минамата. В 1956 году в японской префектуре Кумамото было обнаружено высокое содержание метилртути – опасного даже в минимальных количествах нейротоксичного яда. Его нахождение в воде было обусловлено сбросом в океан неорганической ртути и её соединений, которая затем встраивалась в метаболизм микроорганизмов. В связи с кумулятивностью этого яда, его содержание росло вместе с ростом его носителя в пищевой цепочке. В устрицах залива Минамата содержалось до 85 мг/кг этого соединения, тогда как концентрация его в воде составляла всего лишь 0,6-0,7 мг/л.

Теоретически использование такого чувствительного и селективного метода, как спектрофотометрия, могло бы позволить обнаружить даже незначительные количества метилртути в образцах воды из залива. Таким образом, спектрофотометрия выступает важным методом анализа и оценки сточных вод.

Выбор длинны волны

При проведении фотометрического измерения источник света как правило генерирует световой поток по всему видимому (и не только) спектру длин волн. Источники света современных биохимических анализаторов как правило охватывают диапазон от ближнего ультрафиолета и до всего видимого красного диапазона.

Как уже говорилось ранее молярный коэффициент поглощения является функцией от длинны волны и следовательно исследуемый раствор будет обладать разными коэффициентами поглощения на разных длинах волн. При этом на практике, в основном для того, чтобы избежать влияния неспецифических факторов, измерения проводится на какой-то одной определенной длине волны.

Для выбора длины волны на заре лабораторной диагностики существовало такое наивное эмпирическое правило: если мы видим, что раствор окрашен в какой-либо цвет, то нужно выбрать для измерения длину волны по цвету, отличающуюся от цвета раствора.

Помимо того, что данный подход слишком упрощен, он еще и не применим к ультрафиолетовой части спектра.

Более научный подход заключается в построении графика зависимости оптической плотности раствора от длинны волны.

Поскольку измеряемые биохимическими методами биологические вещества, как правило не обладают достаточной собственной оптической плотностью, для их детекции используются различные специфические химические реакции, которые в итоге и генерируют вещества обладающие достаточной оптической плотностью, в этом случае говорят, что реакция идет с увеличением оптической плотности. Либо в процессе реакции такие вещества расходуются, тогда реакция идет с уменьшением оптической плотности.

Для выбора длинны волны для конкретного метода проводится построение двух графиков зависимости оптической плотности раствора от длинны волны:

для субстрата (субстратов) химической реакции
и для продуктов (продукта) химической реакции

После построения графика берется длинна волны, на которой разность оптической плотности у субстратов и продуктов реакции максимальна.

Для примера можно взять так называемый оптический тест Варбурга.

Данная реакция заключается в обратимом окислении никотинамидадениндинуклеотида (НАД) под действием какого-нибудь фермента из класса оксидоредуктаз.

В результате мы имеем два графика для окисленной и восстановленной формы НАД одна из которых играет роль субстрата, а другая продукта реакции в конкретных биохимических наборах.

Оптический тест Варбурга

В результате анализа данного графика видим, что наибольшая разница оптической плотности между этими двумя формами находится в районе 340 нм. Именно эта длинна волны и используется для определения перечисленных выше биохимических показателей.

Устройство, которое преобразует свет от источника в световой поток с какой-то одной определенной длинной волны называется монохроматор.

Основные типы монохроматоров:

Абсорбционный светофильтр — самый первый монохроматор, по большому счету представляющий из себя просто цветное стеклышко
Дифракционный светофильтр
Призма
Дифракционная решетка — в настоящее время у большинства лучших биохимических анализаторов монохроматор представляет из себя голографическую дифракционную решетку

Таким образом, если включить в нашу схему простейшего фотометра монохроматор (например призму), то она будет выглядеть следующим образом.

Фотометрия на определенной длинне волны

Спектрофотометрические методы анализа

Спектрофотометрия широко применяется для установления связи между спектрами поглощения различных веществ и их химическим строением и составом, а также для количественного определения веществ.

Абсорбционная спектрометрия основана на тех же законах светопоглощения, что и фотоколориметрические методы, однако, в отличие от последних, в ней используется поглощение монохроматического света с очень узким интервалом длин волн (1-2 нм). Это значительно увеличивает чувствительность и точность количественного анализа окрашенных растворов, поглощающих свет в видимой области спектра, а также «бесцветных» для глаза растворов, которые поглощают излучение в ультрафиолетовой (200-400 нм) или ближней инфракрасной области спектра.

Спектрофотометры подразделяются на регистрирующие и нерегистрирующие. В регистрирующих приборах результаты всех измерений автоматически записываются на специальном бланке, имеющем вид сетки.

Нерегистрирующие спектрофотометры обычно включают источник излучения, монохроматор, приемник излучения и отсчетное устройство. Количественные измерения пропускания производятся сравнением сигналов приемника при попеременной установке в световой пучок образца и эталона. При измерениях поглощения светового потока жидкостями обычно пользуются двумя идентичными кюветами, одна из которых заполняется исследуемым раствором, а другая (пустая или наполненная растворителем) играет роль эталона, пропускание которого принимают за 100%, а оптическую плотность считают равной нулю.

К нерегистрирующим спектрофотометрам с кварцевой оптикой относятся модели СФ-4, СФ-4А, СФ-16, обеспечивающие возможность производить измерения, помимо видимой и ближней инфракрасной, также в ультрафиолетовой области спектра.

К нерегистрирующим спектрографам со стеклянной оптикой относится модель СФ-5, используемая для измерений только в видимой и ближней инфракрасной области спектра.

Нерегистрирующие спектрофотометры имеют одинаковую оптическую схему, но несколько различаются электрическими схемами и методикой измерений.

Принципиальная оптическая схема спектрофотометра СФ-16, с пределами измерения оптических плотностей 0-2 и пропускания 100-0, 10-0, 100-90% представлена на рис. 186. Свет от источника 1 попадает на зеркало-конденсор 2, которое направляет пучок лучей на плоское зеркало 3, поворачивающее лучи на 90° и направляющее их на входную щель монохроматора 4. Зеркальный объектив 6 направляет параллельный пучок лучей на призму 5, которая разлагает его в спектр и возвращает его обратно на объектив 6. Луч, прошедший призму под углом близким к углу наименьшего отклонения, попадает на выходную щель 7, расположенную под входной. Поворачивая призму вокруг оси, можно получить на выходе монохроматора лучи различных длин волн. Выходящий из монохроматора пучок света проходит фильтр 8, кювету с исследуемым раствором 9 и попадает на фотоэлемент 10. Фототок, возникающий в фотоэлементе, передается на усилитель постоянного тока. Усиленный ток попадает на милливольтметр.

Спектрофотометр СФ-16 относится к однолучевым приборам, поэтому в процессе измерений на пути потока излучения устанавливаются поочередно «нулевой» и испытуемый образцы. Происходящие при этом изменения интенсивности излучения, падающего на фотоэлемент, вызывают изменение напряжения в системе усилителя, которое компенсируется путем изменения напряжения на потенциометре, связанном с отсчетным устройством.

Включение прибора в сеть производится согласно прилагаемой к нему инструкции, в которой также даются указания относительно техники работы с ним.

Методы измерения поглощения света

Найти абсолютные значения интенсивности светового потока до (I0) и после (I) прохождения его через раствор практически очень затруднительно. Поэтому при измерении поглощения излучений обычно сравнивают два световых потока: один проходит через испытуемый раствор, а другой через определенный стандартный раствор или через растворитель (нулевой раствор, поглощение которого условно принимается равным нулю).

Сравнение можно проводить визуально или посредством фотоэлектрических приборов, в которых приемником излучений служат фотоэлементы. Визуально можно лишь констатировать наличие сходства или различия в окраске, но оценить количественно степень различия ее невозможно.

Интенсивность окраски двух сравниваемых растворов выравнивают, изменяя концентрацию (метод разбавления, метод стандартных серий и метод колориметрического титрования), или толщину поглощающего слоя, или интенсивность светового потока (Последнее возможно в том случае, если более интенсивный поток ослабить при помощи измерительной диафрагмы.)

Изменение ширины щели диафрагмы, находящейся на пути одного из двух сравниваемых световых потоков, может быть скоррелировано поворотом отсчетного барабана, отградуированного в величинах оптической плотности D или пропускания Т.

Устройства спектрофотометры

Принцип работы и схема прибора

Спектрофотометры имеют множество вариантов конструкции. В современном мире ИК-спектрометры зачастую используют технологию частичного пропускания ИК-излучения для получения информации о составе образцов. Принципиальная схема такого прибора приведена на рис. 4. Принцип работы такого прибора заключается в измерении степени поглощения ИК-излучения образцом, находящимся между источником излучения и детектором. Отдельно стоит отметить, что современные Фурье-спектрометры используют сложную оптическую систему (интерферометр Майкельсона), разделяющий потоки излучения и создающий интерференционную картину при помощи этого. Подвижное зеркало позволяет создать необходимую для исследования разность хода лучей, что приводит к получению сложной картины – интерферограммы, которая затем претерпевает Фурье-преобразование и становится ИК-спектрограммой.

Приборы, работающие в видимой и УФ-части спектра, обладают несколько иным принципом действия. Существует две основных схемы таких приборов, с разным расположением монохроматора. Эти схемы приведены на рис. 5 и рис. 6. Принцип их работы заключается в сравнении отраженного пучка излучения от исследуемого образца и от стандартного образца, оптическое поглощение которого принято считать равным нулю. По разности интенсивности пучка излучения можно судить об оптической плотности исследуемого вещества, а затем, в соответствии с законом Бугера-Ламберта-Бера, становится возможным установление концентрации исследуемого вещества. За качественное определение в таком случае отвечает длина волны, при которой происходит поглощение света.

Оценка чувствительности аппаратов

Спектрофотометры обладают достаточно высокой чувствительностью. Из-за особенностей и требований метода анализа спектрофотометры зачастую настраиваются по-разному для различных испытаний, поэтому их чувствительность незначительно изменяется. Основными параметрами для этих оптических приборов служат ширина полосы пропускания, аппаратная функция установки и разрешающая способность установки. Аппаратная функция лишь показывает степень отклонений, вносимых в измерения самим прибором, когда как разрешающая способность и ширина полосы пропускания могут изменяться и зависят от параметров монохроматора, источника излучения и их сочетания.